2020年11月16日,近日,美國圣路易斯華盛頓大學栗衛凱課題組在Science雜志上以研究長文(Research Article)的形式提前在線發表了研究成果“Structural basis of antagonizing the vitamin K catalytic cycle for anticoagulation”,通過解析不同氧化還原狀態的人源膜蛋白VKOR,河豚魚同源蛋白VKORL與各種拮抗劑,底物的復合體共11個晶體結構,揭示了華法林等維生素K拮抗劑的作用機理及幾乎整個維生素K催化循環的機理。


栗衛凱組揭示華法林等維生素K拮抗劑的作用機理


維生素K和拮抗劑的作用機理之所以未知,研究難點在于VKOR是一個特別不穩定的整和膜蛋白,一旦離開自然的膜環境就立即失活。為了克服這個技術困難,文章的第一作者劉世軒發明了一種膜蛋白尾端融合策略 (文章即將發表在Science Advances上),加上配體共純化,這樣才成功的獲得穩定的人源VKOR蛋白,并且采用脂立方相(lipid cubic phase, ?LCP)結晶方法,最終得到了分辨率最高達2.0 ?的晶體結構。


晶體結構顯示,VKOR蛋白結構的四個跨膜螺旋和位于內質網腔的頂蓋區域共同形成了一個由大量疏水殘基形成的活性中心。在這個疏水的“口袋”中,四種不同維生素K拮抗劑,包括世界上最常用的華法林,法國常使用的phenindione,超級華法林brodifacoum和chlorophacinone, 都同樣通過兩個關鍵的氫鍵分別與VKOR第139位的酪氨酸(Y139)和80位的天冬酰胺(N80)作用。這種疏水環境中的氫鍵形成了非常強的極性相互作用。突變這兩個氨基酸殘基,Y139F和N80A,都會產生華法林不抑制和導致病人的耐藥性。除了這兩個氫鍵,四種拮抗劑疏水基團與組成疏水口袋的許多疏水氨基酸都有相互作用,其中最重要的是各種π-π相互作用。晶體結構還清晰表明,拮抗劑的拮抗能力差異與其疏水側基與VKOR的結合能力相關。超級華法林Brodifacoum側基團最大,而且與第二第三螺旋形成的通道中的氨基酸殘基有較強的疏水性相互作用,所以在這四種拮抗劑中,抑制VKOR的能力特別強,無愧于其超級華法林的稱號。華法林的代謝產物則不宜結合,解釋了為什么細胞色素代謝酶也影響華法林劑量控制。


結構分析還發現,眾多的氫鍵,鹽橋等維系著頂蓋區域的穩定。雖然它們與華法林并無直接相互作用,但是當氨基酸突變導致相互作用缺失時,會影響頂蓋區域的穩定性從而影響華法林的有效性。這樣,造成華法林等耐受性的氨基酸突變其實分為兩類,一類與華法林直接相互作用,另一類則會導致維系頂蓋區域的相互作用喪失。對于特定的個體,這個發現有助于改進華法林的用量的預測方法,真正有助于個人精準醫療。


沒有配體的人源VKOR蛋白很不穩定,如何知道配體結合有沒有導致VKOR蛋白的構像變化呢?作者們選擇了自身比較穩定的來自于河豚魚的高同源性VKORL蛋白。與VKOR-華法林的復合物結構相比,VKORL蛋與華法林的復合物結構幾乎沒有太大改變。這說明可以通過研究VKORL來解釋VKOR的作用機理。比較沒有配體結合的VKORL結構和VKORL-華法林的復合物結構,發現蛋白質構像發生了很大變化,從開放構像變成了閉合構像。閉合狀態的VKOR結構更為緊湊,這也解釋了為什么人源VKOR蛋白有華法林等存在時比較穩定。重要的是,華法林和VKOR的局部相互作用誘導了這個蛋白總體構象的變化,


那么,底物是怎么與VKOR結合的呢?當純化后的VKORL與不同氧化態的維生素K底物共結晶時,它們都進入不到活性中心的位置,而是微弱的結合在通道區域。只有當活性中心的半胱氨酸殘基135(C135)處于還原狀態時,這些底物能夠進入到活性中心的位置。這時候,C135與不同的底物形成電荷轉移復合體(charge transfer complex,CT)或形成共價鍵。作者們用核磁共振實驗佐證了底物-酶共價復合物的存在。在這兩種情況下,VKOR的構像都處于閉合狀態。這些說明,底物與酶的穩定結合需要C135處于還原狀態,以形成底物-酶加成物,誘導VKOR的構像從開放轉變為閉合狀態。更有意思的是,這種閉合狀態直接誘導了巰基和二硫鍵的傳導,保證了VKOR需要通過電子傳遞鏈來保持的催化活性。底物被還原后,C135處于氧化狀態,底物被排擠出活性中心位置,通過通道區域釋放出來;或者停留在通道中等待VKOR再次激活以進行下一步催化反應。VKOR同時代表了一個大族的膜氧化還原酶,從植物和細菌里都有同源蛋白 -- 它們的功能是催化其他的蛋白的二硫鍵的形成和氧化性折疊。相對于細菌同源蛋白和別的家族的膜氧化還原酶,脊椎動物里VKOR這種底物誘導產生的整體構象變化還是第一次發現。所以,揭示VKOR整個催化循環對理解不同家族的膜氧化還原酶的作用也是一個重要突破。


與VKOR-華法林復合物結構相比,底物同樣結合在VKOR的疏水口袋中,而且與同樣的兩個氨基酸殘基Y139和N80形成強的氫鍵來幫助催化。這兩個氨基酸殘基的突變Y139F和N80A, 同樣顯著降低VKOR的催化活力。而且,如上所述,底物的結合同樣的也誘導閉合構像。這些說明,華法林對維生素K的拮抗,是對底物與VKOR的局部相互作用及底物誘導的總體構象變化的雙重模擬。


此外,晶體結構表明,華法林既能結合氧化態的VKOR, 也能結合半氧化態的VKOR。作者們以前的活細胞質譜研究表明,這兩者占細胞中VKOR總量的90%左右 (NSMB, 2017)。但不同的是,維生素K在催化過程中只結合半氧化或還原態的VKOR。這些VKOR分子將隨著底物的還原而被徹底氧化。華法林結合能力很強,從而減少了能參與循環的VKOR酶的總量。同時,半氧化狀態與華法林結合時,活性VKOR的量將會進一步減少??傊?,這樣獨特的與氧化還原態相關的作用方式,加上局部結合和總體構象的雙重模擬,賦予了華法林近乎不可逆的結合能力,極強的抑制能力和抗凝血功效。


這項研究是自1929年維生素K發現以來,首次從分子水平解釋其催化轉化機理。也是維生素拮抗劑近70年的臨床應用后,首次清晰明確地揭示它們的拮抗機理。同時,這項研究揭示了臨床上華法林耐受性和華法林代謝的機理,提供更多可以判斷劑量的依據,朝著真正的個體化精準醫療邁進一步。而且為更安全有效藥物的開發提供了結構基礎及新的思路。此外,從膜蛋白制備和結構生物學技術上說,此研究采用的尾端融合策略也為更多難以獲得的不穩定蛋白,結構解析和蛋白質工程提出了新的解決思路。


研究背景


維生素K拮抗劑是最常用的處方藥之一。在過去的半個多世紀,維生素K拮抗劑一直是使用最廣泛的甚至是唯一的口服抗凝藥物。這些拮抗劑被用來治療或預防血栓相關疾病,比如肺栓塞、深靜脈血栓和房顫引起的心肌梗塞、中風等。另一方面,嬰兒出生時需要常規注射維生素K來預防自發性出血。維生素K和維生素K拮抗劑的廣泛應用挽救了大量的有凝血功能障礙的新生兒和血栓病人。


維生素K拮抗劑用于血栓治療有很長的歷史。1954年,第一種拮抗劑華法林被批準應用于人體凝血治療。盡管有將近70年的臨床應用,人們對維生素K拮抗劑的機理卻知之甚少。臨床上,維生素K拮抗劑的最嚴重問題是劑量難以控制--用量不足會導致血栓,但過量使用很容易引起大出血甚至死亡。正因為這種大出血的特性,(超級)華法林同時還是最常用的殺鼠藥。深入理解VKOR的催化機理及拮抗機理,將有助于開發更安全的維生素K拮抗劑的使用策略及更安全有效的藥物。


活性態的維生素K是下游一系列凝血因子活化所必需的輔因子。產生它需要依靠維生素K過氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase,VKOR)。由于這個內質網膜上的酶保證了維生素K的循環利用,VKOR位于一系列凝血過程的上游。通過抑制VKOR活性,維生素K拮抗劑實現對活性態維生素K的量的控制,從而抑制下游凝血因子的活化來減少血液凝集。


文章來源: BioArt

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